基因工程碩士論文范文:馬氏珠蛋白基因及Toll受體基因之克隆與功能分析

來源: www.126151.tw 作者:lgg 發布時間:2013-08-30 10:06 論文字數:34900字
論文編號: sb201308281238207919 論文地區:中國 論文語言:中文 論文類型:碩士畢業論文 論文價格: 150
分離鑒定珍珠貝礦化相關基因與免疫相關基因,不僅有助于深入研究貝殼以及珍珠形成的分子機制,揭示貝類免疫規律,在理論上具有重要意義。同時,也能夠為通過生物工程育種手段獲得新品

1. 文獻綜述


1.1 生物礦化
生物誘導的礦化作用受環境的影響較大,沒有專門的細胞組織或生物大分子調控,形成的晶體取向隨意。而生物控制的礦化作用是在不受外界環境影響的,在少量有機基質的精確調控下,在生物體的特定部位,經歷核化、生長和相變等過程,最終形成具有獨特晶體習性和規則晶體排列的生物礦物聚集體的過程[4]。本論文中所討論的生物礦化就是生物控制的礦化作用。軟體動物貝殼和珍珠的形成是受有機大分子控制最為典型的生物礦化過程。形成的貝殼主要是由包括方解石和文石結晶與有機基質緊密結合而組成的高度有序的多重微層結構,由于有機基質的參與使得貝殼和珍珠這種高度有序的晶體復合物與無機成因的 CaCO3晶體相比而言有很多特殊的性質,如極高的強度、優秀的斷裂韌性、減震性能、表面光潔度以及其它許多特殊的功能[5]。為納米材料、仿生材料等新型材料的開發提供新思路[6-7]。同時貝殼和其衍生物珍珠因其光澤的外觀、美麗的形狀而成為人們喜愛的裝飾品之一,具有很高的經濟價值。珍珠也是一種非常有價值的藥物,早在 2000 多年前中美洲將其應用于牙齒的移植[8]。在我國古代,如六神丸、鎮驚丸、等 20 余的中藥中使用了珍珠粉等?,F在的外科整形手術中,珍珠粉也被廣泛用于刺激造骨細胞的生長[9]。近年來還發現將珍珠質移植進哺乳動物或者人體的骨骼系統而沒有發生排異反應,這為將珍珠質用于治療人類骨質疏松癥以及骨骼損傷等相關疾病帶來期望[10-13]。因此,對貝殼和珍珠成因的大分子及其調控機制成為國內外學者們研究的熱點。


1.2 馬氏珠母貝貝殼與珍珠形成研究現狀


1.2.1 貝殼的超微結構
貝類生物礦化作用的最終產物是貝殼或珍珠。貝殼的形態多變,但是一般而言軟體動物的貝殼從外向內依次分為外側的有機層(角質層)與內部的鈣化層[14]。角質層(periostracum)是由硬化蛋白構成極薄的未礦化有機層,內部的鈣化層是生物礦化形成的,由外側茶褐色的棱柱層(prismatic layer)和內側有光澤的珍珠層(nacreouslayer,nacre)組成[15]。兩者礦化的結晶的形態是不一樣的,棱柱層主要的碳酸鈣晶體是方解石(acclite),而珍珠層主要的碳酸鈣晶體是文石(arganotie),兩種晶型主要區別在于晶體中 Ca2+與 CO32-的距離不同而導致穩定性不同。在熱力學角度,方解石要比文石略為穩定一些。掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)下棱柱層通常是由大量平行排列的柱狀方解石晶體構成[16],其橫截面呈多邊形,每個多邊形的柱狀晶體都由一層有機基質包圍[17]。貝殼的珍珠層由文石晶體沉積而成,電鏡下觀察到其中單個的文石板塊約厚 0.4-0.5μm、寬 5-10μm,呈擬六方體形,各板塊(tablet)按層狀緊密排列成“類似密縫式砌磚” 結構,文石板塊間以及層狀結構間由有機基質填充,使得文石片層的排列非常緊密[18-19]。文石晶體的這種“密縫式砌磚結構”與有機基質相的緊密結合,使得珍珠層抗斷裂能力較單純的文石晶體高出 3 個數量級,也使得珍珠層成為材料學研究的熱門材料之一[18],[20-26]。除此之外,貝殼的鈣化層還有許多不同的構造,較為常見的有方解石沿貝殼方向一層層排列形成的葉狀層,以及由片狀的文石晶體交叉平行排列而形成的交錯層纖層[27-28]。關于珍珠的形成也是生物礦化研究的熱點之一[29-31]。由于珍珠的形成基本與貝殼珍珠質的形成相似,只不過前者是珍珠囊的產物,后者是外套膜的產物。珍珠囊細胞分泌出珍珠質在外來物質周圍形成文石碳酸鈣沉積,最終形成珍珠[32]。所以珍珠其實就相當于球形的貝殼。研究珍珠層形成機理,對于揭示珍珠和貝殼形成的奧秘,促進珍珠產業的發展,開發珍珠產品的應用都具有重要的意義。


2.DPT 基因的克隆表達與功能研究


2.1 引言
貝殼形成是一個非常復雜、精密調控的過程,貝殼各層的形成既有其自身的特點,離手段及蛋白含量較少等因素的限制,對蛋白功能的研究還停留在推測階段。目前,貝殼基質蛋白的分離與純化工作剛剛開始,生物礦化相關功能基因的分離鑒定更是方興未艾。已有的研究表明,自然條件下構成貝殼的碳酸鈣晶體并不是在單一蛋白作用下形成的,而是多種蛋白共同作用的結果,不同蛋白的表達受到嚴格的調控。因此,不僅應該對貝殼基質蛋白及其基因做進一步分離和篩選,同時還應該對可能在礦化過程具有調控作用的蛋白進行分離鑒定,并深入研究相關蛋白在貝殼形成過程中的作用機制。皮連蛋白廣泛存在于各類動物的細胞外基質中,行使著細胞間的相互作用和基質的組裝作用。此外皮連蛋白在脊椎動物一些礦化組織中存在,比如骨骼和牙齒等[136],在骨骼和牙齒的形成過程中起到非常重要的作用。在貝類中皮連蛋白初次提取于淡水光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrata)的交錯層纖,被認為是貝殼基質蛋白中重要的組分[56],[137],同時是不可溶的基質蛋白。因此推測它在生物礦化中為晶體的結晶、成核、生長提供結構上的支持[138]。因此對皮連蛋白的功能和作用機制研究對揭示貝殼和珍珠的礦化機制打開了一扇門。


3 TOLL 樣受體基因的克隆表達與功能研究............. 39-46
    3.1 引言............ 39-40
    3.2 材料............ 40
    3.3 方法............ 40
    3.4 結果............ 40-44
        3.4.1 TLR3 RACE 的結果............ 40-41
        3.4.2 TLR3 RACE 的序列分析............ 41-42
        3.4.3 TLR3 熒光定量的結果............ 42
        3.4.4 TLR3 RNA 抑制試驗的結果............ 42-44
    3.5 討論............ 44-45
3.6 小結............ 45-46


結論


(1)RACE 獲得 TLR3 894bp 的部分 cDNA 序列,該片段可編碼 168 個氨基酸,3’-UTR為 385bp,polyA 長 13 個 A。
(2)qRT-PCR 檢測 TLR3 基因在 8 個組織中均有表達,在血淋巴中表達最為明顯,其次是在閉殼肌中,在其他組織中表達較為穩定。
(3) RNA 抑制試驗結果:當 TLR3- dsRNA 探針注射量達 5ug 時 TLR3 的表達量下調 17%,注射量為 30 g 時,TLR3 表達量下調 49%。注射 PolyI:C(500 g)后 TLR3 的表達量上調了 52.2%。
(4)NF-κb 的變化:當 TLR3- dsRNA 注射量為 30 g 時,NF-κb 表達量下調 52.29%.注射 PolyI:C(500 g)后 NF-κb 的表達量上調了 57%。相同的處理情況下 NF-κb 的表達變化與 TLR3 的變化一致。


參考文獻
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